简略质量研究案例（六）-分析方法验证那些事

对于老生常谈的分析方法验证（analyticalmethod validation），小编以为，是通过过程用数据来说明分析方法的可行性，以证明所用的分析方法适用于相应的检测要求。

一、哪些项目需要进行方法验证呢？

1、鉴别实验；

2、原料（指API）或制剂中有效成分含量的测定；

3、制剂中其他成分，如抗氧剂、抑菌剂及其他认为需要进行监控的成分含量的测定；

4、原料或制剂中杂质（包括工艺杂质和降解杂质）的定量或*；

5、溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。

二、分析方法验证所包含的内容：

1、专属性Specificity；

2、准确度Accuracy ，也被称为回收率Recovery；

3、精密度Precision（包括重复性Repeatability、中间精密度Intermediateprecision和重现性Reproducibility）；

4、检测限（Detection Limit，LOD）；

5、定量限（Quantitation Limit，LOQ）；

6、线性（Linearity）；

7、范围（Range）；

8、耐用性（Robustness）。

三、各项内容的具体解析

1、专属性Specificity：

专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该方法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。如方法专属性不强，应采用多种不同原理的方法予以补充。鉴别反应、杂质检査和含量测定方法，均应考察其专属性。

A. 鉴别反应

应能区分可能共存的物质或结构相似的化合物。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈阴性反应。

B.含量测定和杂质测定

采用的色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明各成分在图中的位置，色谱法中的分离度应符合要求。

▪在杂质对照品可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料的试样比较测定结果。对于杂质检查，也可向试样中加入一定量的杂质，考察各成分包括杂质之间能否得到分离。

▪在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的方法或药典方法比较结果。也可用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能存在的降解产物和降解途径对含量测定和杂质测定的影响。含量测定方法应比对两种方法的结果，杂质检査应比对检出的杂质个数，必要时可采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。

综上，专属性包括两方面：

一是对各组分进行定位，以稀释剂和空白辅料不干扰检测评价专属性是否良好；

二是经强制降解后的样品主峰与相邻杂质峰间分离度符合要求（≥1.5）。

2、准确度Accuracy：

准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用回收率%表示。准确度应在规定的线性范围内试验，准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。如上图所示，左边为准确度高的结果，右侧为准确度低的结果。测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。

准确度数据要求：规定的范围内，取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少 6 份样品的测定结果进行评价；或设计高中低3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范围。对于有关物质检查的准确度，还需对定量限水平的准确度进行评价。

A. 化学药含量测定方法的准确度
原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，或用所测定结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中，加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加入已知量的被测物进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一个方法测定结果进行比较。

B. 化学药杂质定量测定的准确度
可向原料药或制剂中加入已知量杂质对照品进行测定。如不能得到杂质对照品，可用所建立的方法与另一成熟方法（如药典标准方法或经过验证的方法）的测定结果进行比较。

C. 中药化学成分测定方法的准确度
可用已知纯度的对照品进行加样回收率测定，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

3、精密度Precision（包括重复性Repeatability、中间精密度Intermediateprecision和重现性Reproducibility）

（如上图所示，左边的图精密度良好，但是准确度不符合要求；右边的图平均值的准确度符合要求，但是精密度较差）。

精密度系指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；

重复性数据要求：在规定范围内，取同一浓度（分析方法拟定的样品测定浓度，相当于100%浓度水平）的供试品，用至少测定6份的测定结果进行评价；或设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。采用至少9份测定结果进行评价时， 浓度的设定应考虑样品的浓度范围。

在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度，中间精密度是考察随机变动因素如不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响，一个完善的分析方法验证应进行中间精密度的测试。

在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。在常规的分析方法验证中，未必都会进行重现性的考察。但是在分析方法从研发实验室转到QC实验室的过程中，通常会进行重现性的考察。

含量测定和杂质的定量测定应考察方法的精密度。

精密度数据要求：应报告偏差、标准偏差、相对标准偏差或置信区间。样品中待测定成分含量和精密度RSD可接受范围参考ChP2015版中9101中可接受范围表。

偏差、标准偏差、相对标准偏差计算公式如下所示：

4、检测限（DetectionLimit，LOD）

检测限是指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。检测限的测定包括以下几种方法：

A.直观法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的低浓度或量。

B.信噪比法：用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的被测物质低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

C.标准差法：

①测定背景10次以上，求出标准差σb；

②将σb乘以三倍；

③在工作曲线上求出3σb相对应的浓度Xb；即为检出限；

④将求得的对应浓度值加上空白值（空白值为0则不加）即得检出限。

5、定量限（QuantitationLimit，LOQ）

定量限是指样品中被测物能被定量测定的低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。定量限试验方法包括：

A.非仪器分析目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的符合准确度和精密度要求的低浓度或量。

B.信噪比法：用于能显示基线噪声的分析方法，即将已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地定量的被测物质的低浓度或量。一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。

C.基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法：按照 LOQ = 10δ/S 公式计算。

式中 LOQ：定量限；

δ：响应值的偏差；

S：标准曲线的斜率。
δ 可以通过下列方法测得：

①测定空白值的标准偏差；

②采用标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差来代替。

定量限数据要求：定量限需同时满足精密度要求和准确度要求。

6、线性（Linearity）

线性系指在设计的范围内，测定响应值或其经数学转化的形式与试样中被测物浓度直接呈比例关系的程度。

应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5种不同浓度的供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。或者可采用描述浓度-响应关系的非线性模型。

线性数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、 y截距（是检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。

7、范围（Range）

范围系指分析方法能达到精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用及其线性、准确度、精密度结果和要求确定。

▪原料药和制剂含量测定，范围一般为测定浓度的80%～120%；

▪制剂含量均匀度检査，范围一般为测定浓度的 70%～130%, 特殊剂型，如气雾剂和喷雾剂，范围可适当放宽；

▪溶出度或释放度中的溶出量测定，范围一般为限度的±30%，如规定了限度范围，则应为下限的－20%至上限的＋20%；

▪杂质测定，范围应根据初步实际测定数据，拟订为杂质报告水平至规定限度的 120%计算，则线性范围应为杂质规定限度的－20%至含量限度（或上限）的＋20%。

在中药分析中，范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其验证范围应大于被限定含量的区间。

范围是综合了线性、精密度，准确度后的结果，不一定与线性范围一致。

8、耐用性（Robustness）

耐用性又称粗放度，系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明，并注明可以接受变动的范围，可以先采用均匀设计确定主要影响因素，再通过单因素分析等确定变动范围。

典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。

液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。

气相色谱法变动因素有：不同品牌或批号的色谱柱、不同类型的担体、载气流速、柱温、进样口和检测器温度等。

经试验， 测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求， 以确保方法的可靠性。

液相色谱的典型变动：

• 流动相PH（±0.5)；
• 流动相组成(有机相±5%）；
• 色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（固定相和填充物相同，尺寸）
• 温度（20-25℃)和流速(±10%）
• 检测波长(±5nm)

气相色谱的典型变动：
• 色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸）
• 温度
• 流速

分析方法的验证比较简单，只要按照指导原则对每一个验证模块去仔细地完成，肯定不会出错。哪怕不是很了解验证的目的，在大框架上也不会出错。当然，对于方法验证中每个模块的深入了解，能帮助我们在日常工作中更好地设计方法学的验证，能让方法学验证更加科学，合理，并且能更加地完成。