敲黑板！！！His标签融合蛋白纯化常见问题和解决方案全收纳

His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。

常用的His标签融合蛋白纯化的填料有Ni Tanrose 6FF（NTA/IDA）金属螯合亲和填料，但是在使用过程这种常常会出现一些问题，这里就给各位老师介绍下常见问题和解决方案

填料清洗

当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。

建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

通过使用 30%异丙醇清洗 5-10 个柱体积，接触时间为 15-20 分钟可以去除此类污染物。然后，再使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液， 清洗填料 2 倍柱体积。例如，含有 0.1–0.5% 非离子去污剂的 0.1 M 醋酸溶液，接触时间 为 1–2 小时。去污剂处理后，需要使用 70%的乙醇清洗 5 个柱体积，以*去除去污剂。后使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。

去除离子作用结合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接触时间为 10-15 分钟清洗。然后，再使用去离子水清洗 10 个柱体 积。

填料再生

组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当填料使 用过程中发现颜色变浅，或者填料载量明显变低时，需要进行对填料进行镍离子剥离和重新 挂镍离子，也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子 剥离和重新挂镍离子。

1) 使用 0.2 M 醋酸溶液（含 6 M GuHCl）清洗 2 倍柱体积；

2) 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；

3) 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱体积；

4) 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；

5) 使用乙醇清洗 5 倍柱体积；

6) 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；

7) 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱体积；

8) 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；

9) 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱体积；

10) 使用去离子水清洗 10 倍柱体积；填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20%的乙醇中，置于 4°C 保存。