液相色谱，你问我答（二）

#1 色谱柱的技术都有哪些？比如，封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里？

答：色谱柱技术包括填料技术，封尾技术和装柱技术等，填料技术自不待言，填料的差异对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响，色谱填料的键合相密度的不同也会影响到填料表面硅羟基裸露的多少，进而影响填料的选择性。封尾技术中用到的封尾试剂的差异也会对色谱柱的性质产生很大的影响，如体现在色谱填料的pH耐受范围，水相耐受范围，极性强弱等。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。

#2 柱子在什么情况下需要更换筛板呢？更换筛板会使色谱柱使用寿命减少吗？

答：色谱柱筛板被样品污染，或被柱头端填料污染了，就需要更换筛板，并且更换柱头端被污染的填料。月旭科技不建议客户自行拆开色谱柱柱头螺丝，最好是寄回厂家维修。色谱柱更换筛板和柱头填料不会对色谱柱使用寿命造成影响。

#3 如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？

答：对一般的反相柱，也就是洗干净后置于纯甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，下次使用前拿出来重新活化一下。

#4 做实验，是用保护柱好？还是不用保护柱好？

答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，且如果保护柱接得好并且尽量控制其匹配性和经常更换，对分离度和柱效的影响并不大。只是在选择保护柱柱芯时千万注意，选择和分析柱填料相一致的保护柱柱芯，否则极有可能影响化合物的分析。

#5 用的是四元梯度泵：A：50%甲醇；B：50%水，经常出现停或进气泡这是什么原因？

答：水/甲醇比例在55/45时，黏度和柱压有个极大值。50/50接近了这个极值，柱压是比较高的。但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径。系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

#6 填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明？

答：资料显示：在正常条件下，填料粒度＞20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种：

① 高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；

② 径向加压法，Waters专L；

③ 轴向加压法，主要用于装填大直径柱，如DAC；

④ 干法柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。

#7 如果不使用不锈钢接头，而改用peek头，是否可以完Q解决接头匹配问题？

答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，Valco，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。

#8 做多肽药物时，流动相A：0.1%或者1%TFA水溶液，流动相B：0.1%或者1%TFA乙腈溶液，基线波动大，流动相中不加TFA时见不到主峰，基线良好。

答：很明显这是TFA加入流动相里，走梯度情况下造成的基线波动。TFA优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，TFA的紫外最大吸收峰低于200nm，因此在低波长下容易出现基线干扰。解决办法可以建议在其中一瓶流动相中等比例加入另一瓶流动相的溶液。

#9 三lv乙酸流动相使用完之后如何冲洗色谱柱比较好？

答：流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用TFA作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的TFA通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。因为TFA也属于一种离子对试剂，因此最好也使用冲洗离子对试剂的步骤冲洗色谱柱，即50%甲醇水低流速反冲过夜。若是分析蛋白样品，建议按照10%甲醇--乙腈/水/TFA (50/50/0.1)，低流速反冲过夜。

#10 药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为300Å，300Å与100Å对结果有什么区别？

答：在做多肽类样品的时候，300Å孔径的填料相对100Å孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。因为蛋白分子量＞2000，会对进入120Å填料的孔造成困难，从而进不了孔，没有保留，就在填料表面，随着溶剂一同出峰。我们一般选择填料的时候，要求孔径至少是分子直径的三倍，从而保证分子可以进入到孔内。