液相色谱，你问我答（三）

01. 正相硅胶柱一般保存在什么溶剂里面比较合适？

短期和长期都建议保存在正相测定所用的流动相中，一般是正己烷和极少量的异丙醇 (95/5, 99/1, 99.5/0.5均可)。
 

02. 磷酸缓冲盐损耗色谱柱，为什么？使用磷酸盐缓冲液与其它缓冲液相比，会使色谱柱寿命缩短多少？

首先需要纠正大家一个误区，对色谱柱来说，pH＞6.5并不是大家理解的“中性环境”。当缓冲盐pH＞6.5时，对硅胶色谱柱来说是偏碱性的环境，故对硅胶基质是有损的。加上磷酸盐分子小，易进到键合相内部造成键合相水解。因此经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，色谱柱寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些。但用磷酸盐也有其不可取代的优点，如性质稳定，缓冲能力强等。
 

03. 反相离子对色谱法中，离子对是如何起作用的？

首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物，降低其极性，这样就能较好的在色谱柱上保留。再者，根据疏水效应理论，离子对试剂的疏水端是很容易和C18链相互作用的，这样更容易在柱子上保留。所以离子对试剂作用是混合保留机制，即离子对保留机制，和样品与离子对生成紧密的结合物，离子对试剂掩蔽化合物中的极性基团，形成的变相反相保留机制，两种作用共同作用。
 

04. 四丁基铵类离子对试剂与烷基磺酸钠离子对试剂有何不同？为何四丁基铵类离子对试剂对色谱柱寿命影响如此大？

四丁基铵类离子对试剂确实不如烷基磺酸钠等离子对试剂用得普遍，原因是酸类极性物质很容易通过降低pH值的方法提高在反相色谱中的保留能力，降低pH可抑制酸的电离，使酸处于中性状态而与疏水碳链的作用力增强。而碱类分析物则受硅胶基质pH上限的严重影响，流动相pH很难调到很高，故分析碱性化合物的时候，常采用低pH下加入阳离子对试剂。
实验表明，四丁基铵类离子对试剂比烷基磺酸钠等阳离子对试剂更难从填料表面去除，故而色谱柱寿命折损比较严重。
 

05. 同一根色谱柱，做完项目A后再做项目B，为何保留时间会变化？为何峰形会异常？会发生怎样的变化？

色谱柱被强保留物质污染，即常说的填料变性后，保留时间提前和滞后的情况都有，具体要看污染物的性质，还要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情况，情况比较复杂，更是很难预测实验结果。平时维护的时候，注意在测定后将污染物用可以将其溶解的溶剂反冲清洗，就可以减轻或避免这种情况的出现。

06. HPLC进行柱前衍生目的是什么？

色谱技术中的化学衍生法系指在色谱过程中用特殊的化学试剂（一般称为衍生化试剂或标记试剂），使样品成分转变为相应的衍生物之后进行分离检测的方法。目的为：1.将紫外-可见强吸收功能基团引入被检测对象，或加入荧光基团将其转变为荧光衍生物，以提高检测灵敏度；2.提高对分析样品的分离和选择性。

07. 多个样品不好分离的时候，该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度？

提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效；选择性和固定相选择以及pH条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性；保留因子主要与流动相组成和比例有关，其次流动相pH和离子强度影响目标物存在状态，也会影响保留因子。有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。
 

08. 苯基柱，氰基柱该什么时候考虑用？

苯基柱用于含苯环的芳香族化合物的测定时，具有较高的选择性。CN柱可作为一个保留能力最弱的反相柱使用，也可作为一个活性降低的正相柱使用。
 

09. 同样类型柱子还有长度，粒径等差异，这些该怎么去选择？

长度和粒径都是用来改变柱效的，选择原则是够用就好。当待分离物质≤5个时，150mm柱长的色谱柱可以满足大多数样品的分离。
 

10. 好奇宝宝提问：普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗？正相色谱体系中Z常用也最普通的是哪种色谱柱？正相柱在使用过程中与反相柱相比有什么需要注意的地方？

正相色谱分离模式是指固定相的极性比流动相的极性大，反过来，流动相极性大就是反相。C18固定相属于疏水性相对比较强的，疏水性强就是极性很弱，应该找不出极性比它更弱的流动相了。况且色谱柱在使用时，要注意极性固定相尽量避免极性溶剂，非极性固定相尽量避免非极性溶剂，否则可能发生类似“相似相溶”的作用。

正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，最普通的应该就是硅胶柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱对水分非常敏感，流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大，因此正相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长。