全面解析GST亲和层析

1 概述

谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是生物体内的一类重要的代谢酶，参与外源和内源有毒物质的代谢。GST通过催化还原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物质偶联反应，使有毒化合物的水溶性增加从而更容易排出体外，最终达到解毒的作用。利用这个原理，将GST做成标签表达出融合蛋白，与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合，从而纯化出目标蛋白，再用特异性的酶将GST标签切除从而得到天然蛋白。

2 GST标签

GST标签是一种常见的标签，它能够增加外源蛋白的可溶性，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表达，适应范围广，能够提高外源蛋白的稳定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特异性，纯化方便、温和。但它也有一定的缺点，比如分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，因此纯化后需要去除标签，并且如果蛋白不可溶，很难用变性的方法纯化。

3 GST亲和层析

GST亲和层析是利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价结合，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。该纯化柱中，凝胶手臂上通过硫键结合一个GSH，然后利用其与GST-tag之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的GSH结合，从而将标签蛋白与其他蛋白分离开。

4 月旭GST亲和层析填料

5 GST融合蛋白纯化步骤

1、将GST Tanrose 4FF 装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2、将样品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保证目的蛋白与GST Tanrose 4FF充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3、用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4、使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5、依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

6 应用实例

层析柱：PreCot 5ml GST 4FF；

样品：重组表达GST标签蛋白；

结合缓冲液：20mM PB , 150mM NaCl, PH7.4；

洗脱缓冲液：15mM还原型谷胱甘肽, 50mM Tris PH 8.0。

7 常见问题解答

1. GST蛋白结合效率低，该怎么办？

①可能原因：上样流速太快，结合时间太短。

解决方法：降低流速，保证足够的结合时间。

②可能原因：缓冲液不合适，柱子平衡不到位。

解决方法：将缓冲液pH控制在3-12之间，用至少5倍的柱体积平衡柱子。

③可能原因：样品中GST融合蛋白浓度太低。

解决方法：先浓缩样品，再进行纯化。

④可能原因：GST蛋白发生变性或聚集。

解决方法：选择合适的细胞破碎方式；发生聚集时可尝试添加1-10mM的DTT促进蛋白溶解；GST蛋白与核酸结合或蛋白之间结合时可添加适量NaCl（100-300mM）。

2、GST蛋白洗脱困难，该怎么做？

①可能原因：洗脱强度不够。

解决方法：增加洗脱体积数；调整洗脱缓冲液pH（8-9）或离子强度（100-300mM氯化钠）。

②可能原因：非特异性吸附。

解决方法：洗脱缓冲液中加入1%-2% Triton X-100。

③可能原因：洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化了。

解决方法：洗脱缓冲液需现配现用，也可尝试加入1-5mM的DTT。

3. GST蛋白纯化后纯度太低，该怎么做？

①可能原因：GST融合蛋白降解。

解决方法：加入蛋白酶抑制剂防止降解。

②可能原因：在宿主细胞内表达过程中GST标签脱落。

解决方法：尝试更换宿主细胞或者优化序列。