液相色谱，你问我答（四）

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我们的《液相色谱，你问我答》已经发布三期了您困惑的问题，还有没出现的吗？如果有，那就快来看看这次有您想要的答案吗~

Q1 我听说有正相色谱和反相色谱，我想了解下什么是正相色谱？什么是反相色谱？它们有什么区别呢？

答：其实正相色谱和反相色谱是由流动相和固定相极性大小差异来分类的，通常正相色谱固定相极性比流动相极性大，常用的流动相有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等。而反相色谱刚好相反，是流动相极性比固定相极性极性大，常用的流动相有甲醇、乙腈、四氢呋喃、水等。反相色谱是目前Z通用的HPLC方法，大约95%的色谱工作者都在使用。

Q2 那我手上有一根色谱柱，我怎么知道是使用于反相色谱还是正相色谱呢？

答：目前来说，常用的反相填料有：C18、C8、C4 和苯基等；正相填料有：硅胶、氨基、氰基、二醇基等。

Q3 我通常看到有不同长度和内径的色谱柱，我能了解下色谱柱的长度和内径不同对我的色谱分析有什么影响呢？

答：对于色谱柱的长度和内径，我们可以基于我们需要分析的物质的复杂程度来选择，两支同填料的色谱柱，柱长越短，分离时间越快，但柱越长分辨率将会更好，同时压力也将更大，可结合样品的复杂性和希望分离的时间来选择合适的柱长。对于色谱柱的内径，窄径柱可提高柱的灵敏度，并可明显降低溶剂的使用量；宽径柱可以将系统死体积的影响降到Z低，载样量高，抗污染。下表可供我们选择色谱柱时对柱内径的一个选择。

Q4 那我想用不同内径和长度的柱子来进行色谱方法转移，我该怎么调整色谱条件呢？

答：对不同内径和长度的色谱柱，我们可以使用以下方法来转换进样量和流速：

Q5 我在看色谱柱的使用说明书中，通常都会提到柱体积，那我怎么计算我手上色谱柱的柱体积呢？

答：基本上色谱柱的柱体积计算公式都差不多，这里列举月旭色谱柱柱体积计算：
以4.6mm×150mm的柱子为例：
柱管体积=πr2L=π×(0.23)2×15=2.49cm2=2.5ml
2.5ml×70%(没有填装的体积)=1.75ml=1个柱体积 

Q6 现在色谱填料的粒径也有很多种，那我在色谱分析工作中，该怎么选择色谱柱的中填料的粒径呢？

答：目前市场上主要可供选择的分析用填料粒径主要有以下几种：
1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪
3.0μm、3.5μm-----快速液相色谱柱：普通快速分析
5μm-----常规分析
其中5μm的粒径是Z常用的，但是这里是指平均粒径是5μm，也有可能有3μm和5μm粒径的填料。
当然色谱填料的粒径越小，理论塔板高度越低，相应的柱效越高，分离度和灵敏度就越好，而且在高线速度区域，柱效的降低也得于缓和；但是压力会成倍上升。通常我们会结合色谱柱的长度来综合选择色谱柱的粒径，下表可作为色谱柱填料粒径选择的一个参考。

Q7 那色谱填料的孔径，我在测定什么样的产品需要考虑呢？

答：现在多孔填料的 95%以上表面积在孔内部，这样只有分析目标物进入孔内，才能达到分析分离的目的。而只有样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部。对于小分子的反相分离，选择小孔径（60Å ~120Å）填料柱，对于小分子和多肽，使用100Å ~150Å，而只有当目标物的分子量大于2000 时我们才会选择300Å孔径的填料。 

Q8 那填料的比表面积对我的分析物之间有什么关系呢？

答：每克填料的比表面积与孔径和粒径有关，随着孔径的增加，比表面积降低。目前比表面积一般为：180m2/g-350m2/g，随着比表面积增大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加（梯度洗脱尤为注意）。我们在日常色谱分析工作中可根据需要选择合适的比表面积。

Q9 我在日常的色谱分析中，经常看到色谱条件中提到色谱柱的封尾，什么色谱柱的封尾？为什么要封尾呢？

答：由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖 50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三J基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。

Q10 封尾与不封尾的色谱填料有什么区别呢？

答：封尾消弱硅羟基作用；不封尾提高硅羟基影响，增强极性物质的保留，降低柱流失，但是有些物质会在不封尾的柱子上产生拖尾。