蛋白质纯化注意事项
更新时间:2021-12-20 点击次数:3002
在蛋白质纯化过程中,需注意几个问题。首先,提纯过程中始终要控制pH值,尽量避免由于过酸或过碱而引起蛋白质构象的不可逆变化。缓冲液要有合适的pH值,又要对蛋白质无害,在提纯植物和菌类中的蛋白质时,通常需要较大的缓冲容量,此时要注意缓冲液的浓度,同时还要注意缓冲液组分是否合适,会不会产生副反应等。含巯基的蛋白质(其中的巯基未结合成二硫键时)特别容易被氧化,因此,要维持一个还原环境。可加入一些含有巯基的还原剂,并使整个体系保持无氧状态,以解决此问题,但在有些情况下,加入的巯基化合物可能会抑制蛋白质的活力。
提纯过程中,通常要保持低温,因为细胞内有蛋白水解酶存在,这种酶在组织匀化后处于活化状态,能降解蛋白质。因此,必须保持低温来降低水解酶的作用。但要注意,有时低温又能使某些酶的四级结构遭到破坏。一般情况下,蛋白质在0℃时比较稳定,但丙酮素羧化酶对冷敏感,25℃时稳定。有些酶则需在-20℃或-70℃下稳定活性。
蛋白质纯化过程中一个最大的问题是在整个纯化过程中,蛋白质或多或少地总是要受到与生理状态极不相同的溶液环境的有害影响。这一点对其功能在活细胞内受高度控制的蛋白质来说是非常值得注意的。相反,有些蛋白质,如分泌蛋白质,却能适应较大的环境变化,而不改变其结构和功能。为了减少蛋白质在稀的水溶液中的自发变性,可以向蛋白质溶液中加入一些小分子量物质(如蔗糖、甘油等)或其他蛋白质(如牛血清白蛋白、明胶等),来稳定蛋白质,这是仿造细胞内环境的一个方法,可以减少水的有害作用。这也是许多基因蛋白质药物中加入白蛋白来作为稳定剂的原因。有时甚至加入二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等,加入的浓度需要试验,一般在1%-10%,少数蛋白质可在高离子强度的极性介质中保持活性,如KCl、NaCl、(NH4)2SO4等。
此外,还有一些常用的办法可有效地减少蛋白质变性,如有些二价离子(Mg2+、Ca2+等)的存在有助于蛋白质或蛋白络合物的稳定;提纯酶时,可以加入专一性的底物;有时候需要使用络合剂(如乙二胺四乙酸盐)除去不需要的离子,特别是那些由水源带来的有害金属离子。这些方法可视不同情况加以利用。
要注意的另一个因素是,在提纯过程中即使很小心,蛋白质也会发生结构上的变化。因此,提纯后的蛋白质,即使其活力基本上得以保留,它的构象也可能不同于天然构象或完整功能的构象。在这种情况下,在生物体外测得的蛋白质的性质未必能准确地反映这些大分子在活体内的性状。
含多个亚单位蛋白质的解离是一种特殊类型的变性。提纯蛋白质时,当所测得的活力是仅由一种亚单位表现出来的时候,其他的亚单位可能会因为注意不到而丢失。有的蛋白质在体内具有多功能形式,其生物活性是由两个以上不同的遗传基因决定的蛋白质一起显示出来的。那么由一个已经纯化的蛋白质的性质去推断它在体内完整的生物学功能时要特别小心。这时分析提纯过程中总的活力是有益的。在提纯的早期阶段,如果用总活力作基准,在提纯结束时希望能回收50%总活力,而实际所能达到的收率往往只有5%-20%。在有些情况下,特别是有大量原料可供利用的情况下,我们可专心致力于获得高比活的样品,而不必顾忌收率。
上述讨论可为提纯蛋白质的基本准则。