液相色谱，你问我答（九）

流动相中含有缓冲盐时，大的原则是：使用前要过渡，使用后要清洗（清洗包括两个步骤，一个步骤是用来清洗缓冲盐，另一个步骤是用来清洗强保留物质的），具体请按如下方式保养色谱柱。

用乙腈：水＝10：90（如果是甲醇体系则用甲醇：水＝10：90）以1mL/min流速过渡30min，约7个柱体积（目的是防止缓冲盐在进入柱子时析出）。

步骤1）用乙腈：水＝10：90（或甲醇：水＝10：90）以1mL/min流速反向冲洗 45min，约10个柱体积（目的是洗去缓冲盐，防止缓冲盐在色谱柱内存留引起使用寿命下降）；

步骤2）再用乙腈：水＝80：10（或甲醇：水＝80：10）1mL/min流速反向冲洗45min，约10个柱体积（目的是洗去分析过程中积累的强保留物质，防止强保留物质在色谱柱内进一步积累，影响以后的分析，也防止强保留物质的积累导致的柱压升高），然后色谱柱保存在乙腈：水＝80：10（或甲醇：水＝80：10）中。

推荐先用正己烷-异丙醇（99：1）以 0.5mL/min的流速冲10倍柱体积，再根据流动相选用极性相近的流动相，相同流速冲10倍柱体积，最后换成流动相。正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要*脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的乙mi、四氢呋喃含有少量）。

先用异丙醇以0.5mL/min的流速冲30倍柱体积，再依次以相同的流速相同的用量用乙腈冲柱子，在过渡到流动相体系。再换成流动相。反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围，pH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。最li想的pH范围在pH2.5~8范围，建议水相<40%以下使用。

正相条件下，可以直接采用流动相平衡系统，使用后用异丙醇以0.5mL/min流速反向冲洗60min，最后保存在异丙醇中，正向使用。

反相条件下使用，先用异丙醇以0.5mL/min流速过渡60min，再用甲醇或乙腈冲洗色谱柱30min以过渡到反相模式。然后再更换成流动相进行平衡如果流动相中有缓冲盐，使用前用采用流动相同等比例的有机相和水相进行过渡，但水相中不含缓冲盐。过渡30min后再换成流动相进行平衡色谱柱。

1）新柱活化：用异丙醇0.5mL/min流速冲洗4个小时，再纯乙腈、70%乙腈水各1mL/min流速各1小时，然后用流动相冲洗至基线平稳进样。

2）流动相配置：建议两项流动相预混合，并且流动相混合前分别采用水膜和有机相膜过滤水相和有机相，然后按照比例配制混合500mL的流动相于同一溶剂瓶中，流动相于同一溶剂瓶中（手动预混合好），充分摇晃溶剂瓶，使两项混合均匀，采用超声脱气20分钟，如果有变热的迹象，放置回到室温。

将流动相放于仪器上，打开仪器泵，检测器，在线脱气机等电源，设置：柱温：45℃，检测器温度：40℃，流速：1mL/min，打开RID检测器参比池，冲洗30min以后，将示差检测器的循环按钮打开，使得流出液从的RECYCLE管路流出（回流管液体流出去20min后），再将回流管放置于流动相瓶子中，进行流动相循环。

3）循环一晚上以后，第二天将流动相循环切换至waste流路，关闭参比池，冲洗样品池30min以后，基线平稳，进样检测。

4）如果1mg/mL浓度乳糖还是没有出峰，配置一个浓度为5mg/mL浓度。

注意：晚上循环时一定是分析样品的流动相色谱条件设置。 

Xtimate^® Sugar-Ca，Sugar-H，填料属于聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物基质，磺化强阳离子交换树脂，在使用过程中首先要避免的情况是流动相试剂污染色谱柱，特别避免使用纯有机溶剂冲洗造成色谱柱填料出现溶胀，改变填料性质造成色谱柱分离效果失去。

Sugar-Ca针对药典测定甘露醇和山梨醇，也可以用测定碳水化合物，各种单糖或聚合糖测定，流动相系统和样品溶剂基本采用纯水体系。

Sugar-H针对药典中利巴韦林测定，也可以用于测定碳水化合物或有机酸类物质分离，所用流动相是硫酸水溶液pH为2.5左右。使用完后基本上采用流动相低温4度封存，在封存过程中时间过久也会有所长菌，故封存一段时间（2~3）周最好换新流动相封存，若长期不使用可以在流动相中加入5%乙醇做改善试剂，避免长菌现象。 

当主峰峰形有所变化，柱效有所降低时，需要进行再生；

Sugar-Ca保护柱的再生方法与Sugar-Ca分析柱方法一致，根据相关的样品纯度有不同的变化，越是天然物（尤其是含有那些重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品），越需要经常地对柱子进行再生，因为它们会与柱子发生置换。可以通过注射蔗糖来测试柱子的置换情况。如果蔗糖的峰有拖尾，那么柱子需要做以下处理: 配制500mL的再生溶液（Ca EDTA 500mg/L Cas:23411-34-9），把柱子流路方向反过来，在85℃以 0.5mL/min的流速冲洗一整夜。再生之后回到正常方向使用。

Sugar-H柱子的再生方法根据相关的样品纯度有不同的变化，越是天然物，（尤其是含有那些重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品），越需要经常地对柱子进行再生，因为它们会与柱子发生置换。如果主峰有拖尾，那么柱子需要做以下处理: 配制 500mL的再生溶液（pH2.5的稀硫酸），把保护柱和分析柱作为整体将流路方向反过来，在85℃以 0.5mL/min的流速冲洗一整夜。再生之后回到正常方向使用，当柱子反冲时很重要的一点是需要保持溶剂的温度从而确保正确的冲洗，用冷的溶剂将会延缓冲洗的过程。