液相色谱，你问我答（十）

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问：我要开始开发一个新的HPLC方法。验证之后，该方法将转道QC实验室并将使用许多年。我担心该方法的长期的重复性，特别是柱子的长期重复性。怎样才能确保好的重复性呢？

答：首先，我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。如果可以预料到该方法将要使用好几年，在选择柱子方面就要做些功课。要想使柱子在该方法的可预见的适用期内使用，就要选择一些大的生产厂家。另外，要选择一种标准的表面化学物质（比如C18或C8）而不是那些新奇的或很少使用的。

下一个标准才是柱子的重复性，如果你或你的同事以前用过一根柱子有很好的重复性，这是一个很好的起点，同时也要考虑生产商提供的信息。近来有的厂家开始印刷他们的说明和不同批次的重复性实验的结果。你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。

问：我该从这些信息中寻找什么呢？

答：我们先来解释一下不同柱子和批次之间重复性的不同方面。下面就说一下反相填料，因为他们更加普遍。

如果你用同一批填料的不同柱子，将会得到不同的塔板数（峰宽），不同的柱压，不同的保留时间。保留时间与填料密度和柱体积呈比例改变，而柱体积则取决于柱子的内径。这个改变对你的方法应该是没什么影响的，因为所有峰的保留时间都呈比例的改变，而分离度还是没变。这个原因导致的保留时间变化的RSD通常在3%左右，但是如果生产商对柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子塔板数的变化会影响方法，特别是做双峰的时候，它们很少能达到基线分离的。尽管2-3%的塔板数的标准偏差已经可以达到，但通常还是在±10%，记住塔板数是个平方数，分离度仅仅取决于塔板数的根。所以塔板数2%的偏差相当于峰宽1%的偏差。你要确认一下柱子的厂家是有塔板数的上下限，还是只有一个下限，上下限都有比较让人满意。

同一装填程序的柱子其柱压的重复性是相当好的，同一批次变化应不超过±5%。

问：那么批次之间的重复性怎么样呢？

答：如果你注意一下批次间的色谱参数，你会发现同参数会不同，更重要的是批次间分离的选择性也会改变。就是说峰的相对保留会改变，比如他们在色谱图中的相对位置，这对你方法的确定性是不利的。

这种改变是你要尽量避免的，所以你要从厂家那里得到一些消息，他们是怎么确保批次之间重复性的，这包括一些物理，化学，色谱方面的测试。在物理测试中，最重要的一项是装填的表面积，该项参数的变化会直接导致保留时间的变化。所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。通常情况下幅度是±10%，但是±5%也是可以达到的。化学方面的参数最重要的是键合相的表面覆盖率。通常用多少μmol/m² 表示。许多厂家并没有直接给出这个参数，而只说明了C的百分含量。我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度，通常是±10%，低于±4%的也可以达到。

最后你要知道厂家的色谱重复性测试，通常色谱柱会附带一张色谱图，检测的是一些简单的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是这不是一个好的批次间重复性测试。因为这些中性疏水化合物的相对保留重复性相当好，对装填中表面覆盖率的改变是相当不敏感的。好的批次间重复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。在精心设计的测试中，精选的碱性化合物主要与残余硅羟基作用，而中性化合物则主要与键合相作用。只有含有2种化合物的重复性测试才是让人信服的。如果一个厂家是这样测试的并且有好的重复性，那么他的柱子会更加让人放心。

问：我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系，我应该怎样在我的检测中确保一个好的批次间重复性呢？

答：你说的很对，上面的消息只能让你有一个比较大的机会确保重复性。但最后必须用你自己的检测来做重复性测试。有些厂家提供一整套的设备包括不同装填批次的柱子来做这个测试，另外有的厂家则按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的东西。同一装填批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键合反应装填的柱子。如果同一批次是不同天内装填，然后色谱柱编号又不同的时候的时候，你最好询问2次，确保厂家给你的是你要的。

你需要3根不同批次的色谱柱来为你的方法做重复性测试。如果批次间的改变不影响你的检测，那么接下来的时间你的方法应该有一个好的重复性。