蛋白结合的解离常数以及在蛋白检测和亲和分离中的应用

蛋白和配体结合的强弱不同，对于蛋白检测以及亲和分离纯化实验有显著影响。在设计实验时应考虑这种结合强弱影响，以便采用合适的蛋白或配体浓度（包括zui低检测限浓度），估算结合时间，获得最佳并且实用的结果。 这对于室温下易失去活性，或希望尽可能保持最高活性蛋白的纯化尤为重要。

常规的蛋白检测方法，比如ELISA，只能测定实验结束时的蛋白结合数值，不能跟踪整个过程。这不利于获取结合的动力学数据，阻碍了实验的优化。自从上个世纪90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技术后，目前已有几种生物传感器技术，能够跟踪蛋白和配基的real-time结合过程，检测结合的全部过程，给出结合的动力学数据。下图是我在SRU Biosystems用光学生物传感测定蛋白A和不同浓度人类IgG随时间变化的结合曲线。IgG浓度在100μg/mL时，结合在2-3分钟内迅速上升后，缓慢增加。在浓度减小时，结合速度变慢。浓度在6.25μg/mL时，结合在180分钟内持续稳定地增加。浓度小于1μg/mL时，结合仍然进行，但是十分缓慢。

绝大多数生化实验室，没有real-time跟踪检测手段，蛋白检测或者纯化过程中，确定蛋白的浓度和结合时间通常根据结合的强弱来确定，而结合强弱是通过解离常数来判断的。

在化学、生物化学中，解离常数（K_D) 是一种反应的平衡常数，用于测量较大物体可逆地分离（解离）成较小成分的倾向。解离常数是结合常数的倒数。 虽然解离常数是动力学理论的参数， 但是它在生物化学，尤其实验设计上有现实意义的指导作用。

链霉亲和素（streptavidin）是生物化学常用的试剂。它于生物素（biotin）结合的K_D非常小，仅为~10⁻¹⁴M。 强度与共价键类似。前文介绍过，链霉亲和素是非常稳定50K_D蛋白，经常用来与荧光、红外、ELISA标记等化学结合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，带有羧基的小分子。 容易与蛋白化学结合。这样带有标记的链霉亲和素，与带有生物素的蛋白结合，从而避免直接标记蛋白。链霉亲和素和生物素K_D小。对比于直接标记二抗的方法，采用标记的链霉亲和素-生物素的方法用量小、时间短，达到准确检测的目的。基于这种原因，标记的链霉亲和素、化学活化的生物素以及生物素结合的二抗等蛋白检测试剂，比较容易购买，这对于实验方案设计非常便利。