考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

考马斯蓝染色法又称Bradford法，是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

分析天平、烧杯、玻璃杯、移液枪、紫外分光光度计或酶标仪。

①标准蛋白溶液：常用牛血清蛋白（BSA），配制1mg/mL的标准溶液。

②0.01%考马斯亮蓝染色液G-250：称取0.01g考马斯亮蓝G-250，溶于95%乙醇中，加85%(m/V)的磷酸10mL，最后用超纯水定容至100mL，装入棕色瓶中保存。（不宜久存，室温1-2个月）

紫外分光光度计测定

将表格所示溶液加入试管中充分混匀，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度计于595nm测定吸光值，1号管作为空白对照，以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标曲作为定量依据。

②样品测定

取含10-100μL蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1mL，然后加入5mL G-250蛋白染色液，充分混匀，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度计于595nm测定吸光值，1号管作为空白对照，将测得吸光值带入标准曲线计算样品中的蛋白质含量。

酶标仪测定

将表格所示溶液依次加入酶标板中混匀，静置10min后，放入酶标仪中于595nm测定吸光值，A孔作为空白对照，以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标曲作为定量依据。

②样品测定

取含4-40μL蛋白质溶液于酶标板中，加水稀释至40μL，然后加入250μL G-250蛋白染色液，充分混匀，静置10min后，放入酶标仪于595nm测定吸光值，A孔作为空白对照，将测得吸光值带入标准曲线计算样品中的蛋白质含量。

①通常会将样品稀释多个梯度进行测定，防止样品测得吸光值过高，超出标曲导致的含量计算偏差。

②样品中若含有去污剂，如TritonX-100、SDS等，会严重干扰测定结果。

③比色反应需在1h内完成，如果测定要求很严格，可以在染色液加入后的5-20min内测定吸光值，因为在这段时间内颜色是zui稳定的。

④测定时，蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色皿杯壁上，测试完后可用乙醇溶液将比色皿中的残留物冲洗掉，再用超纯水冲洗干净保存。