液相色谱中分离度变差该怎么办？

相信很多小伙伴都遇到过这类情况，色谱柱使用一段时间后相邻色谱峰分离度变差，峰形也变宽，或者在做方法开发时，目标物分离度不好。导致这类情况的原因有哪些？遇到问题后该如何排查？今天就和小伙伴们讨论交流一下。

在液相色谱中，分离度R_s是色谱分离之中最重要的部分，不管色谱最终的目的是定量定性分析还是样品制备，都是在一定的分离度基础上来实现的。分离度计算公式如下：

其中，R_s表示分离度，t_R2表示相邻峰中后一个峰的保留时间，t_R1表示相邻峰中前一个峰的保留时间，W₁和W₂是两个峰在基线处的峰宽W。

色谱峰的保留时间相差越大，或者峰形越窄，就能得到更好的分离结果（分离度增加）。对于色谱分离来说，基线分离有助于获得准确的定量分析结果。两个大小接近的色谱峰，基线分离对应R_s>1.5。

从分离度的计算公式可以看出，造成分离度下降最直观的原因有：峰形变宽、拖尾或前延，保留时间发生变化。所以，导致分离度降低的主要原因有：

1. 色谱柱使用时间太长，柱效下降了；

2. 色谱柱或者保护柱或者系统有污染；

3. 样品被污染变质，导致峰形变宽、拖尾或前延，或出现杂峰干扰；

4. 仪器柱外死体积过大（管路太长，管路内径太大，检测器流通池体积过大等），导致柱效降低，峰形变宽；

5. 柱温的影响。

如果是在日常实验中，碰到分离度降低的情况，首先要排查色谱柱（包括保护柱）是否有污染或者失效，对其进行清洗或更换；其次是要排查样品污染的问题，重新配制样品进行分析；最后排查系统污染和流动相污染的问题，清洗仪器管路，更换在线过滤器并更换流动相。排除上述几种可能性，基本就能解决分离度降低的问题。

如果在方法开发过程中遇到分离度低的情形时，影响因素就有很多了，比如色谱柱类型、填料粒径、有机相的种类和比例、缓冲盐的类型和浓度、柱温、色谱柱的长度等。具体的影响以后会再和大家一一讨论。