反相液相色谱峰拖尾问题，解决全过程！

反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾。究其原因，是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生的次级保留效应（前提：排除色谱柱问题和样品过载问题）。

峰形优化实例分析

-分析物的部分结构-

1、初始方法

以0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液（含0.5%三乙胺，用磷酸调节pH值至3.5）-甲醇（49∶51）为流动相；检测波长为210nm；某未知品牌C18柱；初始结果：峰拖尾，峰宽5min，无法出尖峰。需要做方法优化，达到峰形对称。

2、拖尾原因分析

反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。根据电离规律，当流动相的pH-pKa>2即pH>6.7时，99％以上的硅羟基应是呈离子状态的，即Si-O- 。

而当pKa-pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99％以上的硅羟基应是呈分子状态的，即Si-OH，但其极性仍然存在，为Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。

同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，峰形拖尾。

3、优化方向

抑制硅胶上残余硅羟基与分析物之间的作用，减弱次级吸附作用。

● 减少硅胶上残余硅羟基或减少与分析物间发生作用的残余硅羟基，占据硅羟基这个作用位点。比如，使用彻di封端的色谱柱；在流动相中添加三乙胺（TEA）、四丁基硫酸氢铵等作为减尾剂，竞争残留硅羟基；调节流动相pH。

● 减少与残余硅羟基发生作用的分析物离子，占据-NH2、-NHR、-NR2这些分析物作用位点。比如，加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂。

● 干扰残余硅羟基与分析物间的相互作用。比如加入缓冲盐，增强流动相的离子强度。

4、优化过程

#01、选择合适的高纯硅胶彻di封端色谱柱：Blossmate® Polar RP（4.6*300mm，5μm）。

分析：峰拖尾，峰宽2min，优于初始条件的结果。拖尾的严重程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。相同的样品在不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同。从填料合成的角度而言就是：键合密度是否高、封尾是否彻di。高密键合和彻di的封尾能显著减少静电作用机会，获得良好的峰形。月旭科技Ultimate®系列XB-C18、AQ-C18、Blossmate®系列Polar RP和Xtimate®系列C18采取的就是高密键合和彻di的双峰尾工艺。

#02、降低流动相pH：改为2.5，后续一直使用Blossmate® Polar RP色谱柱。

分析：酸性环境抑制了硅羟基的电离，拖尾稍有改善，但不明显，pH对峰形改善作用较小。

#03、水相添加磷酸二氢钾，减小庚烷磺酸钠浓度，流动相改为：0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺，用磷酸调节pH值至2.5）-甲醇（49∶51）

分析：流动相中缓冲盐爆发出力挽狂澜的气势，峰拖尾现象变成峰前延。

#04、恢复庚烷磺酸钠浓度，流动相改为：0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺，用磷酸调节pH值至2.5）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾，比不加磷酸盐时峰形好。根据3和4的结果可以推断：在0.01mol/L 至0.02mol/L之间范围浓度的庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺，用磷酸调节pH值至2.5）-甲醇（49∶51）可以使得峰形对称。

#05、流动相改为：0.015mol/L庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺， pH 2.8）-甲醇（49∶51）。

分析：拖尾改善，峰形较好。可以看出，调整庚烷磺酸钠浓度对峰形的改善作用较大。

#06、流动相改为：0.015mol/L庚烷磺酸钠溶液（0.5%三乙胺， pH2.9）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾。可以发现，在没有磷酸二氢钾存在的情况下，同时改变庚烷磺酸钠和pH，与1的结果比较，峰形虽有改善，不对称由3.38变为3.13，作用不大。流动相中磷酸二氢钾的存在具有决定性作用。

#07、主要通过调整流动相中庚烷磺酸钠浓度来改善峰形，流动相改为：0.0125mol/L庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺， pH 3.1）-甲醇（49∶51）。

分析：峰前延。

#08、增加庚烷磺酸钠浓度，流动相改为：0.0138mol/L庚烷磺酸钠溶液（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺， pH3.14）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾因子1.24。后续只需微调庚烷磺酸钠浓度于0.0125-0.0138mol/L（含50mmol/L磷酸二氢钾，0.5%三乙胺，微调pH约至2.5），可进一步优化峰形。

#01、相同的样品在不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同，高密键合和彻di的封尾能显著减少静电作用机会，获得良好的峰形。

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#02、流动相中加入磺酸盐离子对试剂能与样品分子作用，从而阻止样品分子与残留硅羟基发生次级吸附作用，进而改善峰形及增加保留。一般加入0.003-0.01mol/L浓度。

#03、流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在-NH3+等极性基团和硅羟基Si-O-之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。

#04、加入三乙胺作为减尾剂改善峰形的时候，有两点需要注意：

● 三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化；

● 三乙胺在210nm处有一定的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N+H(CH2CH3)3的结构N+(CH2CH2CH2CH3)4，这种结构也能有效的与Si-O-产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，在低波长范围其紫外吸收比三乙胺弱，检测波长在210nm以下测定时可选择使用。

● 酸性化合物拖尾需要降低流动相的pH值，尽量使酸质子化；可以通过向流动相中加入竞争的有机酸得到较好结果，如使用0.1%三氟yi酸 (TFA) ，并且这种添加剂具有比较低的紫外截止波长。

参考资料：食品伙伴网