我拿什么分析你，大分子样品！

更新时间：2023-04-06 点击次数：737

体积排阻色谱法（SEC）又称凝胶色谱法，通常用于分子量大于2000的样品的分离。SEC方法zui广泛的用途是测定聚合物的分子量分布，对某些大分子样品如蛋白质、核酸等，也是种很有效的分离纯化手段。SEC方法能简便快速地分离样品中分子量相差较大的组分，因而适合于未知样品的初步探索性分离，无需进行复杂实验就能较为全面地了解样品组成分布的概况。

体积排阻色谱原理

分子的体积排阻，样品组分和固定相之间原则上不存在相互作用，色谱柱的固定相是具有不同孔径的多孔凝胶，在固定相确定的分子量范围内，洗脱顺序按照分子大小分布。当样品分子量较大，以至于被wan全排除在固定相微孔之外时（全排阻），其保留体积等于色谱柱内微粒间的空隙体积；而分子量足够小的分子可以wan全进入微孔中，其保留体积为空隙体积和固定相中微孔体积之和，因此小的溶质分子保留时间长，洗脱体积大，而大的溶质分子保留时间短，洗脱体积小。固定相的分子量测定范围即为全渗透和全排阻之间的分子量范围。

理想的体积排阻色谱固定相应具有窄的孔径分布范围，而系列色谱固定相应具有宽范围的孔径分布，可根据样品的不同选择不同分子量范围的SEC柱，也可将不同规格的SEC柱串联使用，用于分离更大分子量范围的样品。

体积排阻色谱的分类

凝胶过滤色谱法-GFC

一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法-GPC

主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

两种方法的分离原理虽然相同但采用的固定相、分离对象和使用技术wan全不同。

分类	凝胶过滤色谱 GFC	凝胶渗透色谱 GPC
固定相	低交联度多孔聚合物（在有机溶剂中会溶胀）如葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺	交联聚苯乙烯树脂（在有机溶剂中溶胀性较小）如聚乙烯-二苯乙烯共聚物
流动相	采用水溶液或缓冲液作为流动相	有机溶剂，THF，DMF，三氯ji烷等
应用对象	多肽生物大分子蛋白质，纤维素衍生物，聚乙烯醇多糖类	结晶合成聚合物，小分子聚合物
优缺点	条件温和，分离机理简单，操作参数少，耐高温，选择性低	使用广泛，渗透性好，柱效高，不宜长期高温条件使用

体积排阻色谱流动相的选择

体积排阻色谱法中，实际的分离效果与样品、流动相之间的相互作用无关，因此改变流动相的组成一般不会改变分离度。当采用示差折光检测器时，为提高检测灵敏度，应使流动相的折射率与被测样品的折射率有尽可能大的差别。若使用紫外吸收检测器，也应采用在检测波长无紫外吸收的溶剂。

体积排阻色谱法中流动相的选择原则：

流动相对样品应有足够的溶解能力，黏度小，与检测器匹配。

流动相必须与固定相匹配，能浸润凝胶，如对苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相选择非极性流动相；多孔硅胶固定相应选择极性强的流动相。

为增加样品溶解度而采用高柱温操作时，应选用高沸点溶剂。

凝胶渗透色谱主要用于高聚物分子量的测定。四氢呋喃对此类样品有良好的溶解性能，可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被广泛使用作为GPC流动相。但因其在储运过程中特别是在光照射条件下，容易生成过氧化物，使用前必须除去。二甲基甲酰胺、邻二氯苯、间甲酚等溶剂可在高柱温条件下使用；强极性的六氟异丙醇、三氟乙醇等可用于粒度小于10μm的凝胶柱。

在凝胶过滤色谱中，通常以具有不同pH值的缓冲溶液作为流动相。当采用亲水性有机凝胶（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶为固定相时，固定相与样品间可能存在多种相互作用影响GFC测定准确性，可在流动相中添加少量无机盐以保持一定的离子强度（0.1~0.5mol/L），其中钠、钾、铵等的硫酸盐、磷酸盐消除吸附作用的效果较好。当使用硅胶基质凝胶时，流动相的pH值应保持在4~8的范围，以免硅胶键合相被破坏。

月旭产品介绍

月旭科技Xtimate^® SEC填充剂采用du特的化学键合技术，在硅胶表面键合亲水性聚合物以及亲水性二醇基团，双重键合机制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物样品的非特异性吸附极小，因而可广泛应用于水溶性聚合物及生物大分子的分离和测定。

固定相	SEC- 120	SEC- 300	SEC- 500	SEC- 700	SEC- 1000	SEC- 2000
填充剂	球状亲水改性硅胶
孔径Å	120	300	500	700	1000	2000
蛋白分子量范围	500- 150000	5000- 1250000	10000- 3500000	15000- 5000000	50000- 7500000	＞10000000
水溶性高分子范围	500- 25000	1000- 100000	2000- 500000	2500- 500000	5000- 1500000	50000- 2500000
pH	2-7.5
最大压力（psi）	4500	3500	3000	3000	3000	3000

色谱柱的异常冲洗

多次使用后某些样品可能会吸附到入口筛板或填料上。当积累至一定程度时会出现压力升高并伴随峰形展宽的异常现象，需要进行特殊的冲洗。

该冲洗的清洗溶液选择的基本原则：

低pH的盐溶液有助于移除碱性蛋白（如0.5M硫酸钠溶液，硫酸调整pH3.0）。

有机溶剂有助于移除疏水蛋白，可以采用含有机溶剂（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的缓冲溶液（如50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0）。

助溶剂有助于去除在固定相上强吸附的物质（如通过氢键作用等）。

注意：只有在中性盐溶液或有机溶剂没有明显改善效果的情况下使用助溶剂（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸钠）。

流速一般采用1/2做样流速，柱长≤100mm，各项冲洗60min；柱长＞100mm，各项冲洗120min。

上一篇：等度洗脱VS梯度洗脱，如何选择？

下一篇：色谱柱伤不起！关于液相色谱柱使用的6大注意事项

分类	凝胶过滤色谱 GFC	凝胶渗透色谱 GPC
固定相	低交联度多孔聚合物（在有机溶剂中会溶胀）如葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺	交联聚苯乙烯树脂（在有机溶剂中溶胀性较小）如聚乙烯-二苯乙烯共聚物
流动相	采用水溶液或缓冲液作为流动相	有机溶剂，THF，DMF，三氯ji烷等
应用对象	多肽生物大分子蛋白质，纤维素衍生物，聚乙烯醇多糖类	结晶合成聚合物，小分子聚合物
优缺点	条件温和，分离机理简单，操作参数少，耐高温，选择性低	使用广泛，渗透性好，柱效高，不宜长期高温条件使用