干货 | 固相萃取实验成败的影响因素、常见问题

固相萃取是一个目标物在固定相上吸附、解吸附/洗脱的过程，因此影响吸附、解吸附、洗脱的因素都会直接影响萃取的效率，如填料类型、洗脱溶剂的强度、pH、流速等。

填料是固相萃取技术的核心，选择对目标物具有适中吸附性的 SPE柱填料是确保检测准确的前提。当然针对同一种目标物，我们可以选择不同的柱料，但是要注意方法的调整。

固相萃取是固定相-填料与流动相-上样溶剂/洗脱溶剂对目标物的竞争吸附作用，所以在上样时，要选择有机溶剂含量或pH都合适的上样液，以避免目标物在上样时漏掉。而在洗脱时，也必须选择适合的溶剂强度，即有机溶剂的含量或pH，以确保能将吸附在填料上的目标物彻di洗脱下来。

对于离子交换固定相，被分析成分与干扰物质的pKa(等电点)各不相同。通过调节溶剂pH的大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带申荷：或使固定相带申荷，干扰物质带相反申荷，而使被分析物不带电荷。

上样流速和洗脱流速会影响吸附或解吸附/洗脱的效果，上样和洗脱的流速一般控制在1mL/min以内。对于大量样品痕量富集，如环境水样中有机物的富集，上样流速不超过5mL/min。除了以上的几个因素，一些操作步骤完成的情况，如活化的程度、淋洗步骤的抽干等，也会影响结果的回收率或重现。

1. 为什么SPE小柱操作要强调流速？

答：大多数实验人员都希望实验做的又快又好，在固相萃取实验中，往往偏好用比较快的流速过柱。这里就必须要注意流速太快的弊端。因为SPE小柱的填料装填压实以后，形成柱床，当溶剂流过小柱，速度过快将导致两个问题，一个问题是对于键合相填料，由于流速快而使得其不能充分浸润舒展，因而导致其保留活性降低；其次过快的流速导致小柱可能形成沟渠，使得填料未被充分浸润，降低了吸附填料与样品的接触面积，影响了目标物质的传质过程，因而导致回收率降低。

2. 溶剂环境的pH怎么影响化合物在小柱上的保留？为什么我们要关注化合物的pKa值？在C18小柱中需要考虑这些因素吗？

答：首先我们来说一下，Ka指的是酸度系数，又名酸离解常数，可以理解为酸离解H离子的能力，而pKa=-lgKa，对于酸，在环境pH下存在如下平衡：

左边的A-/HA，实际是指溶剂环境下，离子态和分子态的比例，右边反映了左侧两者的转化关系，取决于（pH-pKa)的数值大小。对于离子交换小柱，保持目标物的离子化而非分子态，是一个关键点，这对于离子交换作用机理的交换柱，将直接关系到其实验成败。而对于硅胶键合C18小柱的萃取，由于硅胶（—SiOH）不能wan全“封端"，在pH大于4.0的情况下，硅胶都会带上负电荷，因而会使得能电离的化合物与硅胶作用，增强了这种附带的次级作用力（主作用力为非极性相互作用力），而使得此类物质在硅胶-C18上的保留增强，若只考虑C18的非极性作用力，必然会导致回收结果不尽如人意。

3. 为什么在农残检测过程中GCB常见于净化模式，而不用于富集模式？

答：SPE的净化模式常被用来吸附杂质，而富集模式常被用来吸附目标物质，GCB是一种石墨化碳黑，它由六个碳原子构成平面六角形，并且层叠而成，对于芳香平面分子，很容易嵌入，而具有较强吸附芳香化合物的选择性，对于其他分析物也有较好的吸附性能，填料的吸附与解吸附的性能将直接影响填料的使用范围，对于GCB而言，其吸附性能较强，但是解吸附的可逆性稍差，需要选择合适强度的溶剂来释放被吸附的物质，因而造成了解析溶剂匹配较为困难，由于其对色素等的优秀吸附性能，因而在农残样品处理中，常用来吸附色素等杂质，而不是选择用来保留目标化合物。

4. 淋洗步骤通常需要抽真空干燥，这个原因是什么？

答：淋洗后通常要抽真空干燥，主要作以下考量：

1）通常由于反相萃取在化合物的前处理中使用的比较多，正如反相色谱在色谱中作为常见的分离方法一样，在反相萃取中的淋洗液常为水相或者含水的缓冲溶液，去除水份，可以便于后续干燥浓缩步骤。

2）有的项目，在淋洗步骤完成后，直接用一定体积的洗脱液，比如1mL的甲醇洗脱，此过程将洗脱与定容集为一步处理，前一步的处理必然对洗脱步骤的定量结果产生影响。

3）便是溶剂互溶问题，当淋洗步骤使用的溶剂极性与洗脱溶剂的极性差异较大时，会产生乳化分层，洗脱阻力大，洗脱液被稀释的风险等，导致洗脱效果的差异，以致于实验结果的失败。

5. 我们在使用硅胶键合填料类型的色谱柱的时候，出于对色谱学的常识，知道了硅胶键合填料一般厂商建议的pH使用范围为2-8，那么对于使用硅胶键合的填料的固相萃取小柱，是否需要严格遵守这样一条规定？

答：首先，我们需要了解到，厂家建议的pH2-8的耐受范围，是为了保证色谱柱的正常使用寿命，当pH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解。因此会损害色谱柱柱效和保留特性，但是我们知道这个pH耐受值范围外的溶剂对于色谱柱的影响，主要是一个积累性的过程，在溶剂冲刷下，逐渐溶解而导致色谱柱性能改变和不可逆，寿命减短。SPE小柱和色谱柱的一个差异就是，SPE是一次性消耗品，在耐受的溶剂范围外，短暂时间的溶剂冲刷对于小柱的保留特性影响甚微，并不会导致其保留显著差异，因此其使用的pH范围更宽，一般可以在pH值范围1-10使用，而不会导致其结果的差异性。