如何让你的HPLC数据质量及重现性臻于完美？

01 试剂质量

梯度洗脱比较容易在柱头端累积A和B溶剂中的非极性杂质，会在随后的梯度过程中逐渐释放这些杂质。这些杂质有可能在空白样品和实际样品的测试过程中出现。出于这个原因我们有必要在进行梯度实验的时候使用HPLC级别的试剂。低质量的试剂可能适用于等度洗脱，但是在梯度洗脱中，即便是最微不足道的杂质也可能会造成测试异常的问题。为了获得最佳的实验结果，我们应该确保在所有的HPLC实验中只使用HPLC级别的试剂。

水性试剂和缓冲液应该经常更换，这样可以避免微生物生长而造成的污染，水中的杂质尤其会造成很多问题。

02 系统的清洁

和试剂的质量一样重要，保持仪器清洁有助于减少鬼峰的出现，建议勤冲仪器。如果遇到其他问题，如液体溢出、漏液和其他潜在的污染源都应该及时得到清理。

03 除气

虽然一些HPLC系统在流动相没有除气的情况下也可以运行，但是采用除气后的溶剂会使所有系统的运行都变得更可靠。残存的气泡和溶剂中气体溢出的现象，都可以通过对溶剂的除气而大量避免。

另外，HPLC系统中也会有残存气体，每天都冲洗泵和溶剂的入口管线，不失为一个好主意。我们可以通过开启purge阀和以较高的流速（例如5mL/min）对泵进行几分钟的冲洗来移除泵和管线内的气泡。

04 专用的色谱柱

每个分析方法都应该有一根专用色谱柱。在不同的方法之间共用一根柱子并不是一个好主意，因为一个方法中无关紧要的色谱峰可能会变成第二种方法中的干扰峰。样品成分可能会导致色谱柱的填料选择性发生改变，或者其中一个方法造成柱子的退化。

05 平衡

在每次实验之前，柱子应该恢复平衡到同样的程度，为后续的分离实验做好准备。wan全平衡对于梯度洗脱来说是十分必要的。

06 初始进样

如果在第一次进样之前，进行几次“初始”进样，那么一些方法就可以获得更好的结果。这些标准品或者模拟样品的进样，可以饱和色谱柱上缓慢平衡的活性部位，因此可以获得重现性更好的实验结果。初始进样对于分离生化样品更有用。有时候系统适用性进样也可以用作初始进样。

07 忽略第一次进样

因为一些方法要求使用初始进样的程序，而且第一次进样的平衡状态可能和随后进样的不一致；因此最好避免使用第一次进样做定量分析。第二次和随后的进样比第一次进样更加可靠；在正式进样之前展开的系统适用性试验也能用于这个目的。

08 系统适用性

很多在监管部门（FDA、EPA、OECD、USP等）监管下的方法都要求在分析样品之前做一个系统适用性的测试。系统适用性有助于确认设备和分析方法能够产生可靠的实验结果。

系统适用性测试的要求各有不同，所以相关人员应该咨询有关的法规指导来帮助选择合适的测试方法，很多操作者使用保留时间和峰面积的重现性、色谱峰的响应（检测敏感度）、峰宽、色谱峰的拖尾、分离度和柱压，这些其中一种或者综合的方法，作为系统适用性测试的一部分。

系统适用性的样品可以是稀释了的标准品、萃取基质中的模拟样品或者一些被选用来展示系统性能的样品。这里一个重要的原则是，所选择的系统适用性样品必须可以用来测试方法中的操作是否能达到所期望的目的。无论是否需要进行系统适用性测试，在常规分析之前做一次这样的测试不失为一个明智的选择，哪怕就只是注射一个标准品看看保留时间和峰大小是否和预期一样。

09 标准品和校正品